郑州市博尔利科技有限公司创建于2010年，是一家专业从事生物酶制剂的研发，生产，销售为一体的科技型企业。专为小麦酒精生产研发的高级酶制剂，推出首款超强稳定小麦酒精淀粉酶。公司是由硕士，博士和博士后组成的研发团队， 并与河南农业大学联合建立了产品应用研发实验室。

α-淀粉酶是最重要的工业酶之一，人类胰腺和唾液产生α-淀粉酶也常被用作医学诊断和治疗的生物标志物。很多应用场景下需要对α-淀粉酶活性进行快速准确的检测，但常用的α-淀粉酶检测方法都是基于分光光度法测定淀粉含量的降低或还原糖含量的增加，这些方法通量比较低，也无法实现实时监测。张娜英和杨广宇总结了近年来高通量、高精度α-淀粉酶检测方法的进展。这些方法包括基于葡萄糖氧化酶/过氧化物酶的紫外光谱法-级联酶法，基于荧光底物氟硼二吡咯染料-淀粉之间关系、基于饱和碘-淀粉络合物与荧光素钠之间关系的荧光光谱法以及基于四苯乙烯与麦芽三糖共价连接的荧光探针，以及在线毛细管电泳法、高效液相色谱-光二极管阵列检测器-质谱法、等温定量热法、电化学分析法、免疫传感法、纸基传感法、基于液滴的一次性传感器贴片等。其中，荧光信号偶联液滴微流控筛选技术的BODIPY-淀粉荧光法，可以用于高通量筛选α-淀粉酶突变菌株；四苯乙烯与麦芽三糖共价连接的荧光探针检测限低，线性范围宽，只需要3 min即可完成检测，已用于临床检测。α-淀粉酶在不同领域的广泛应用，带动了对其快速灵敏检测方法的需求，研发更加灵敏的底物和更加通用的方法，不仅对α-淀粉酶的检测十分重要，对其他酶活性的检测也具有参考价值。
摘要：α-淀粉酶是一种内切糖苷水解酶，可以水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键，生成低聚糖、糊精、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶在食品、人体健康监测和制药方面的重要作用，其活性检测广泛应用于工业生产菌株的选育、临床疾病的诊断、糖尿病药物的开发和食品质量的控制中。近年来，随着检测技术的发展，许多更加快速、灵敏的α-淀粉酶检测方法被开发出来。本文综述了近年来α-淀粉酶的检测方法和应用研究进展，分类介绍其检测原理和优缺点，并对未来α-淀粉酶检测方法提出展望，以期为α-淀粉酶检测方法的开发和应用提供参考。
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)是一种内切糖苷酶，广泛存在于动物、植物和微生物，是一种具有广泛底物选择性和产物特异性的酶，能够水解淀粉等多聚糖内部的α-1,4-糖苷键生成糊精、低聚糖、麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖，但是无法水解末端葡萄糖和支链α-1,6-糖苷键^[1]。α-淀粉酶是最重要的工业酶之一，广泛应用于淀粉加工业、发酵业、洗涤业、纺织业、食品业等，约占全球酶制剂市场的30%，仅次于蛋白酶^[2]。其中微生物来源的α-淀粉酶因其稳定性高、易遗传操作、可大规模培养、生产成本低等优点而用于工业生产中^[3]。人类也有2种α-淀粉酶，一种由胰腺产生，另外一种由唾液产生，主要存在于唾液、尿液和血液等体液中，被用作医学诊断和治疗的生物标志物^[4-5]。α-淀粉酶的活性检测在工业酶开发、临床诊断、食品质量评估等领域有重要的应用。在工业生产菌株的选育上，需要评估α-淀粉酶生产菌株的生产能力、酶活、热稳定性等指标^[6-8]。在临床疾病的诊断上，α-淀粉酶的检测主要用于识别与胰腺和唾液腺相关的一些疾病状况，如人血清和尿液中α-淀粉酶活性的测定被广泛用于临床实验室诊断胰腺疾病，唾液α-淀粉酶活性则与压力和焦虑有关^[4,9-10]。据报道，抑制α-淀粉酶活性可减少Ⅱ型糖尿病的发生，是治疗糖尿病的重要药物靶点^[11]。此外，α-淀粉酶的检测在食品质量的把控上尤为重要，α-淀粉酶活性的高低对淀粉类食品的最终质量产生巨大影响^[12]。由于α-淀粉酶的检测在工业研究和临床诊断等领域内的重要性，人们已经开发了许多方法来测量其酶活性。据不完全统计，目前用于测定α-淀粉酶的方法有200多种，常用的传统检测方法有基于淀粉分解中的淀粉溶液的粘度降低、淀粉悬浮液的浊度降低和碘-淀粉显色法以及Bernfeld的还原糖法等^[13-15]，但是，这些基于分光光度测定的方法都有一些缺点，比如涉及多个步骤、耗时耗力，反应不是化学计量，受葡萄糖干扰，反应体积比较大，对样品和试剂的需求量较大，通量低，无法实时监测等缺点，适合要求不太严格和精细的活性分析。为了满足临床检测和药物开发等领域内的新需求，开发新的α-淀粉酶的活性检测方法，提升其检测速度和灵敏度一直是个重要的课题。本文将主要介绍近5年来α-淀粉酶检测方法的应用和最新进展，分类介绍这些方法的检测原理和优缺点。

1   α-淀粉酶检测的应用进展

1.1工业菌株选育和工业酶的研究

α-淀粉酶的活性测量在α-淀粉酶工业生产菌株的选育和工业酶的研究方面有重要作用。不同工业应用领域需要具有不同特性的α-淀粉酶工业生产菌株。在淀粉转化中，淀粉的液化和糖化需要在高温下进行，需要热稳定的α-淀粉酶参与反应，解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均是热稳定的α-淀粉酶的广泛生产者，其中地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌是淀粉加工工业中的优势菌株^[16]。真菌α-淀粉酶具有相似的温和反应条件，最适反应温度为50−55℃，最适pH为5.0−5.5，安全性高，一般用于食品工业生产中^[17]。目前，通过基因工程和定向进化对工业菌株和工业酶的研究作出了重大贡献，例如，为提高α-淀粉酶产量和活性，利用基因工程，选择高效的 α-淀粉酶基因和宿主来生产淀粉酶，将含有感兴趣基因的合适载体插入高效细菌中，以获得高产的重组α-淀粉酶生产菌株^[18]，但是在后续筛选庞大的突变体时往往受到高通量限制。基于碘-淀粉显色和还原糖法的筛选比如平板筛选和96孔板筛选都存在速度慢、效率低的问题。基于荧光激活微液滴分选(fluorescence-activated droplet sorting, FADS)技术的酶活性筛选是近年来出现的一种高通量筛选方法^[19-20]，利用荧光信号偶联策略与基于液滴的微流控筛选技术结合可以极大缩短筛选时间。例如BODIPY-淀粉荧光法为工业上高通量筛选α-淀粉酶突变菌株提供了可行性^[8]。

1.2 临床疾病的诊断

在临床疾病的诊断中，人体液中α-淀粉酶活性变化是某些疾病的重要指标。血清α-淀粉酶尤其是胰腺淀粉酶的活性，对胰腺疾病的准确诊断具有重要意义。血清和尿液中的α-淀粉酶活性升高可提示腮腺炎、胰腺炎的存在和胰腺阻塞。α-淀粉酶活性降低可见于肝炎、肝硬化、肝癌、妊娠毒血症、慢性胰腺炎、急性酒精中毒等^[21-22]。急性有机磷农药中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning, AOPP)是急诊科最常见的危重症之一，血清α-淀粉酶水平与AOPP的严重程度和预后密切相关^[23]。唾液α-淀粉酶(salivary α-amylase, sAA)已被用作影响交感神经系统病理的生物标志物^[24]，如压力、焦虑、抑郁和口腔疾病^[9,25]。最近，有研究表明sAA活性变化可能与视网膜疾病有关^[26]。利用发色基团共价连接的麦芽低聚糖作为α-淀粉酶活性检测的底物已经被广泛应用于临床诊断领域^[27-29]。在这类方法中，尽管已经由需要辅助酶的4,6-亚乙基-4-硝基苯基-麦芽七糖苷(ethylidene-4-nitrophenyl-a-d-maltoheptaoside, EPS-G₇)底物发展到不用辅助酶可直接监测水解释放出发色基团的2-氯-4-硝基苯-麦芽三糖苷(2-chloro-4-nitrophenylmaltotrioside, G₃CNP)和2-氯-4-硝基苯-半乳糖麦芽糖苷(2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-beta-d-galactopyranosylmaltoside, GalG₂CNP) (图1和图2)，但是吸光度受到pH、温度和蛋白质浓度的影响，检测需要额外的仪器来读取信号强度，限制了现场诊断的使用。由于α-淀粉酶检测在临床诊断和药物开发方面的重要性和普遍性，因此，迫切需要开发一种便携式、快速、经济和高效的α-淀粉酶即时检测方法。α-淀粉酶检测的简便性，对诊断α-淀粉酶相关疾病具有重要意义。

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